Метод домінантних летальних мутацій на Drosophila melanogaster

Метод домінантних летальних мутацій на Drosophila melanogaster

У дрозофіли, подібно до клітин ссавців, непрямі мутагени активуються ферментною системою оксидаз. При цьому, ферменти дрозофіли, що метаболізують промутагени, мають значну подібність до ферментів ссавців: зокрема, цитохром Р-450 та багато інших виявлено у мікросомальній фракції клітин личинок та дорослих мух.

Домінантні летальні мутації – це збірна група різноманітних пошкоджень генетичного матеріалу, до якої належать анеуплодія за аутосомами, асиметричні транс локації, великі делеції, втрата цілих хромосом. Частота виникнення домінантних леталей залежить від стадії сперматогенезу. Відомо, що зрілі сперматозоїди дуже чутливі до впливу пошкоджуючих факторів, оскільки ефективність репарації на цій стадії суттєво знижена або ж репарація не відбувається взагалі.

Суть методу полягає у порівнянні частоти виникнення домінантних летальних мутацій ( ДЛМ ) в контролі і за дії досліджуваних речовин. Для постановки однієї серії експерименту  відбиралось 150 віргінних самок і 100 самців дикого типу (лінії Oregon); їх обробляли речовиною, яку досліджували на мутагенність, в установці: 200г банки з капроново-сітчастим дном поставлені на чашки Петрі з фільтрами змоченими досліджуваними розчинами. Для дослідів використовували самців, які перебували на затравці одну добу. Оброблених самців схрещували з інтактними  віргінними самками. Через добу запліднених самок в банках з капроновими сітками садили на зафарбоване агарове середовище на чашки Петрі для відкладання яєць. Середовище готували наступним чином: кип’ятили 30 г агару в 200 мл води з наступним додаванням 2,5 г активованого вугілля, після чого розливали в чашки Петрі товщиною 2-3 мм. Агарове середовище охолоджували при кімнатній температурі і покривали дріжджовою суспензією ( 8 г дріжджів на 20 мл води).

Через кожні 5-6 годин, мух в досліді і контролі паралельно перекидали на нові чашки Петрі. В свіжих яйцекладках підраховували кількість відкладених яєць, а потім після 48 годин термостатування ( t =24˚С ) – кількість яєць , що не розвивалися ( серед них розрізняють незапліднені ( прозорі ), яйця з ранньою (матові) та пізньою ( з кольоровим відтінком) ембріональною загибеллю ).

Частоту домінантних леталей підраховували в відсотках за формулою :

                                      Кількість яєць з ДЛМ

Частота ДЛМ  =  ---------------------------------------  х 100%

                                   Кількість запліднених яєць

Статистичну обробку результатів проводили по критерію оцінки достовірності різниці між відсотковими характеристиками двох альтернативних сукупностей за коефіцієнтом Стьюдента. Достовірною вважалася різниця при  t ≥2,3. 

Анателофазний аналіз на меристемних клітинах корінців Alliumcepa.

Суть методу полягає у виявленні хромосомних аберацій, які виникають у меристем них клітинах корінців Allium cepa при пророщуванні на досліджуваних субстратах.

Для аналізу використали насіння цибулі ріпчастої. Насіння кількістю 50-60 шт. розкладали на чашки Петрі, в яких знаходились диски фільтрувального паперу змочені досліджуваними зразками. Пророщували насіння при температурі 22˚С. Через 3 доби, коли довжина корінців досягла 0,5-1 см, насіння промили дистильованою водою і перенесли у бюксики з фіксатором. Фіксацію проводили у вечірній час (18-20 год.),коли кількість мітотичних поділів для даного виду максимальна, і повторювали свіжою сумішшю через 3-4 години. Загальна тривалість фіксації – 24 години. Для фіксації використовували фіксатор Кларка (етанол і льодяна оцтова кислота 3:1). Промивали у 96% спирті. На тривале збереження переносили у 70 % спирт.

Виготовляли тимчасові давлені препарати корінців цибулі. Переносили корінці в склянку з водою, помішували, поки не опустяться на дно (фіксатор в клітинах був замінений на воду). Вийняли корінці і посушили фільтрувальним папером. Переносили в тигель і заливали фарбою (ацетоорсеїном). Доводили до кипіння шість разів протягом 20 хв. з інтервалом 3-4 хв. Охолоджували під кришкою. Зафарбовані корінці використовували для виготовлення препаратів. Для цього на обезжирене предметне скло помістили зафарбований корінець. Відрізали і залишали меристему (2-3 мм). Зверху накривали покривним скельцем, шматком фільтрувального паперу відбирали надлишок ацетоорсеїну. Притримуючи покривне скельце, надавили тупим кінцем препарувальної голки так, щоб клітини розшарувалися в один шар. Розглядали препарати під мікроскопом.

Клітини аналізували на стадії анафази, коли відстань між ділянками хромосом на полюсах більша від розмірів самих хромосом, а також на стадії ранньої телофази – на початку утворення фрагмопласту.

Під час підрахунку дотримувались наступної схеми:

• кількість корінців на зразок 12-14

• кількість полів зору 3-4;

• кількість досліджених клітин – не менше 2000.

Основними типами аберацій, які виявляються ана-телофазним методом є делеціії і транслокації.

Підраховували мітотичний індекс (МІ) за формулою:

де П – кількість клітин в профазі, М – в метафазі, А - в анафазі, І – кількість інтерфазних клітин. МІ виражають в промілле, тобто кількістю мітозів на тисячу клітин.

Зменшення мітотичного індексу свідчить про пригнічення процесу поділу клітини під дією досліджуваного препарату. Зменшення МІ може відбуватися як за рахунок затримки клітин в мітозі, так і за рахунок вступу в поділ великої кількості клітин. Для визначення відносної тривалості кожної з фаз мітозу підраховують фазовий індекс (ФІ) за формулою. Для профази вона є такою:

для інших фаз мітозу відповідно.

Фазовий індекс дозволяє судити про зміни в співвідношенні фаз мітозу, про зміну тривалості тої чи іншої фази. Так, збільшення кількості метафаз і, відповідно зменшення кількості ана- і телофаз свідчить про вплив препарату (субстрату) на веретено поділу, що веде до нерозходження хромосом до полюсів. Збільшення кількості профаз може відбуватися за рахунок подовження профази або пришвидшення процесів синтезу в інтерфазі і вступу клітин в мітоз. 

Метод індукції соматичних мутацій і рекомбінацій на D. melanogaster

У соматичних клітинах відбувається процес аналогічний мітотичному кросинговеру – соматична рекомбінація, суть якого полягає в тому, що він здійснюється при поділі соматичних клітин. Звичайно, гомологічні хромосоми в профазі мейозу розміщуються незалежно одна від одної, але деколи відбувається обмін ділянками між несестринськими хроматидами гомологічних хромосом, іншими словами – соматична рекомбінація. У дрозофіли соматичний кросинговер може відбуватись як спонтанно, так і під впливом зовнішніх факторів.

Аналіз соматичної рекомбінації є важливим при прогнозуванні канцерогенних властивостей хімічних реагентів здатних викликати початкові незворотні зміни клітин – мішеней, тобто ведуть до стадії неконтрольованого поділу клітин. В соматичних клітинах організмів, які підлягають обробці досліджуваною речовиною найзручніше використовувати лінії y i sn D. melanogaster, що несуть в гомозиготному стані рецесивні гени, які визначають колір очей, форму і колір личинок.

Розрив між sn і центромерою призводить до утворення подвійної плями, тобто такої, де дві сусідні клітини проявляють дію генів : одна у, а інша – sn. При наявності соматичних рекомбінацій в прших поділах виникає мозаїчний організм, особина якої має нормальний набір хромосом, а друга частина – аномальний. При повторній рекомбінації організм буде побудований з трьох і більше клітинних популяції, які відрізняються складом хромосом.

Самок вирощували з sn у співвідношенні по 5 особин. Через кожні 72 години батьків пересаджували у пробірки зі свіжим середовищем.
% рек. = (кількість самок з мозаїчними плямами / загальну кількість) * 100%

Статистичну обробку – результат досліджень рекомбінантної активності проводили по критерію оцінки достовірності різниці між % характеристиками двох альтернативних сукупностей по Стюденту.

Метод індукції соматичної рекомбінації є найбільш чутливим серед застосованих у практиці генотоксичного аналізі методів, оскільки він дає повний аналіз генетичної нестабільності, який охоплює і генні, хромосомні і геномні мутації, які виникають у мутаціях соматичних клітин. 

Розведення ароматизаторів

Дослідні концентрації зразків вираховували наступним чином: рекомендовану технологічну дозу, яка розрахована на 1 кг продукції зменшували вдвічі (враховуючи, що за день людина може спожити не більше півкілограма готової продукції) і множили на середню масу людини (70 кг). Така концентрація нами названа добовою. Досліджували також дозу, збільшену в 10 разів від добової.

Наприклад!!!(цього в зошит не писати, це я навела приклад, щоб ви зрозуміли) Рекомендована доза ароматизатора «Ваніль» фірмою «Akras» дорівнює 0,4 % на 1 кг. Розведення проводили на 200 мл., тоді:

1000 мл – 0,4

200   мл –  х

х= (200_*0,4)/1000 = 0, 08% (добова доза), відповідно доза збільшена у 10 разів становить 0,8% на 200 мл.

З повагою ІЦ "KURSOVIKS"!